Vitrificação automatizada de crio

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 2985 (2022) Citar este artigo

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A velocidade e a eficiência da coleta de dados e processamento de imagens em microscopia crioeletrônica aumentaram na última década. No entanto, as técnicas de preparação de espécimes criogênicos ficaram para trás e são necessários dispositivos de preparação de espécimes mais rápidos e reprodutíveis. Aqui, apresentamos um dispositivo de vitrificação com manuseio de amostras altamente automatizado, exigindo apenas interação limitada do usuário. Além disso, o aparelho permite a inspeção de filmes finos por meio de microscopia de luz, uma vez que o excesso de líquido é retirado por sucção por tubos, não absorvendo papel absorvente. Em combinação com o controle do ponto de orvalho, isso permite a preparação de filmes finos de maneira controlada e reprodutível. A vantagem é que a qualidade da amostra crio preparada é caracterizada antes da aquisição dos dados da microscopia eletrônica. A praticidade e o desempenho do dispositivo são ilustrados com resultados experimentais obtidos pela vitrificação de suspensões de proteínas, vesículas lipídicas, células bacterianas e humanas, seguidas de imagens usando análise de partícula única, tomografia crioeletrônica e microscopia eletrônica e de luz criocorrelacionada.

A criofixação em água vítrea (gelo amorfo) por congelamento rápido de amostras biológicas pode fornecer preservação estrutural quase perfeita de amostras biológicas como suspensões de proteínas, vírus, bactérias e células eucarióticas. A criofixação requer uma taxa de congelamento alta o suficiente (>100.000 °C/s) de modo que a formação de gelo (cristal) seja evitada. Como resultado, a água adota um estado transitório metaestável e amorfo semelhante ao vidro1. Usando a vitrificação, a estrutura de proteínas e células pode ser preservada em seu ambiente hidratado nativo para resolução atômica. Amostras vitrificadas são compatíveis com as condições de vácuo necessárias para microscopia crioeletrônica (cryo-EM) e também podem ser estudadas com microscopia óptica de fluorescência de luz (cryofLM)2. A microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM)3 reúne as vantagens do EM (alta resolução, contexto estrutural) com as vantagens da ampla gama de técnicas de microscopia de luz disponíveis (imagens ao vivo, rotulagem versátil)4,5.

A vitrificação por congelamento por imersão usando etano líquido, ou uma mistura de etano/propano como criogênico6, demonstrou ser uma abordagem prática para a criopreparação de amostras biológicas de até 10 mícrons de espessura1,7. Para cryo-EM, proteínas purificadas e suspensões de vírus são preservadas em finas camadas de água medindo várias dezenas de nanômetros, a partir das quais reconstruções de resolução atômica podem ser determinadas usando SPA8,9. Estruturas maiores, como bactérias e células aderentes de até alguns mícrons de espessura, também são adequadas para vitrificação. Reconstruções tridimensionais com resolução molecular podem ser determinadas por meio de tomografia crioeletrônica (crio-ET) de amostras de até aproximadamente meio mícron de espessura10,11. Minimizar a espessura da camada líquida é importante, pois o meio ao redor da amostra espalha elétrons, adicionando ruído de fundo nas imagens, diminuindo assim a relação sinal-ruído nas imagens e reduzindo a resolução alcançável nas reconstruções tridimensionais resultantes.

A etapa essencial de gerar uma fina camada de amostra líquida em um suporte de amostra de microscopia eletrônica para EM (normalmente uma camada de carbono com orifícios suportada por uma grade de cobre de 3,05 mm de diâmetro) é problemática, pois camadas finas de água são inerentemente instáveis ​​e para ter controle exato sobre o espessura da camada de água é difícil. Verificou-se que tornar o filme de suporte hidrofílico por descarga de brilho no ar ou alquilamina12,13 ajuda a formar uma fina camada líquida no filme de suporte e um ambiente saturado úmido ajuda a estabilizar a camada fina. A prática comum atual é aplicar vários microlitros de solução de espécime a um filme de suporte descarregado por brilho, seguido de absorção do excesso de fluido usando papel de filtro que é subseqüentemente congelado por imersão14,15.